食品中志贺氏菌要检测哪些东西？志贺氏菌的检测方法及标准解析-凯发k8旗舰厅

2022-10-24

发布：国科检测

志贺氏菌病常为食物暴发型或经水传播。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉，生的蔬菜、奶和奶制品、禽肉、水果、面包、汉堡包及有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方，如餐厅、食堂。因此食品检测中志贺氏菌病检测项目必不可少，那食品中志贺氏菌检测方法及标准有哪些？

食品中志贺氏菌要检测哪些东西？志贺氏菌的检测方法及标准解析

5 检测方法

5.1 分离培养

增菌：称取待检样品25g，加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的500ml广口瓶内，固体食品应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品应用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于（36±1）℃培养6～8h。

分离培养：取增菌液1环，划线接种于志贺氏菌选择性琼脂平板或志贺氏菌显色培养基上，于（36±1）℃培养18～24h。观察平板或培养基上菌落形态，根据志贺氏菌在不同培养基上的菌落特征进行可疑菌落的判定。

5.2 生化鉴定

挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体各一管。志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层变黄、不产气（福氏志贺氏菌6型可微产气），斜面不变色，不产生硫化氢，无动力；在半固体管内沿穿刺线生长。应进一步做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶，西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵尿素、kcn、水杨苷、七叶苷试验，志贺氏菌属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌，并以生化试验方法做4个生化群的鉴定。具有以上特性的菌株，疑为志贺氏菌，可做血清凝集试验。

5.3 血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于k抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查，再用a1、a2、b群、多价d群血清分别试验，如系b群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查，确定菌型。福氏志贺氏菌型鉴定的方法：可先用群因子血清检验，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏志贺氏菌多价血清1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清确定菌型，如果不是鲍氏志贺氏菌，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。

5.4 分子生物学鉴定

5.4.1 dna模板的制备

取增菌液1ml于小离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μl灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液作为pcr模板。

5.4.2 引物设计

上游引物为5′-gttccttgaccgttccgataccgtc-3′；下游引物为5′-gccggtcagccaccctctgagagtac-3′。扩增片段长度为629bp。

5.4.3 pcr反应体系

反应体积25μl：10×buffer2.5μl，taqdna聚合酶（2u/μl）0.5μl，mgcl2溶液（25mmol/l）3μl，dntp（25mmol/l）1μl，ddh2o14μl，上游引物（10μmol/l）1μl，下游引物（10mol/l）1μl，模板2μl。

5.4.4 pcr反应参数

95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min。4℃保存。

注：pcr反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。

5.4.5 电泳

用核酸电泳缓冲液（tae）制备1.8%～2.0%的琼脂糖凝胶，取5μlpcr扩增产物，分别和2μl上样缓冲液混合进行点样，用dna分子量标记物做参照，3～5v/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。